层析过程色素来源及去除方法

每个做层析的研究人员，估计对色素都不陌生吧，层析过程中，色素问题是个很头疼的问题，有的一次上样后，填料直接变成黄色，灰色，粉红色，看起来不美观，这都是次要的，关键是直接影响填料的分辨率，收率，产品质量和填料寿命。 下面从色素来源、原理及去除方法等方面做个系统的总结。

一、色素的来源

1.培养基组分 ：铁离子、维生素 B12（尤其是转化为羟氧-B12后） 等成分在培养过程中与 蛋白质和抗体分子结合，形成粉色或黄色色素（如色氨酸氧化导致黄褐色）。

2.金属离子反应 ：铁离子在高 pH 环境下生成氢氧化铁沉淀，造成填料黄褐色和红褐色污染。这些铁离子可能是来自于反应培养基残留，也又可能来自于管路，溶液器皿。

3.酶促反应 ：比如毕赤酵母发酵产品，在诱导中后期，AOX1 醇氧化酶会释放出来，结合黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）形成八聚体，就会形成绿色色素。

4.工艺设备接触 ：金属设备溶出离子，特别是金属容器或培养基氧化性组分（如 B 族维生素）与蛋白质相互 作用。

二、色素的特性及作用原理




不同色素由于其化学性质差异，与填料的结合强弱也不一样：

●疏水作用 ：疏水性色素（如脂类）与填料疏水基团结合。

●离子键/共价键 ：带电荷色素（如阴离子色素）与离子交换填料静电吸附 ；羟氧-B12与蛋 白质半胱氨酸残基共价结合。

●分子筛效应 ：大分子色素被凝胶过滤填料截留。

污染后表现为填料颜色加深、载量下降 ，严重时导致填料塌陷。

三、色素去除方法

1. 针对性清洗（根据色素类型）

●铁离子色素（黄褐色） ：

●0.5M 磷酸处理 8-12 分钟 ：高效溶解氢氧化铁，避免长时间处理导致铁离子二次吸附

●禁用高盐/表面活性剂（无效）

●维生素 B12 衍生色素（粉色） ：

●0.3M 组氨酸+0.5M NaCl（pH4.0 ）  ：破坏 OH 自由基

● 1M 醋酸+4%半胱氨酸 ：切断共价键

●疏水性色素（如脂类） ：

●0.5M 非离子去污剂、70%乙醇或 30%异丙醇 ：利用相似相溶原理。

●顽固沉积色素 ：

●混合试剂法 ：1M NaOH+2M NaCl、6M 盐酸胍或 8M 尿素，接触时间＜30 分钟

2. 层析工艺优化


●亲和层析 ：优化缓冲液破坏色素与填料的离子吸附

● 阴离子交换 ：中性条件下色素带负电荷，可通过流穿模式吸附或高盐洗脱

●疏水层析 ：利用色素与蛋白疏水性差异，调整盐类型/浓度梯度分离

●凝胶过滤 ：分子量差异大时，通过脱盐柱或高分辨分子筛去除

3. 预防与维护

●上游控制 ：选择低铁/维生素需求的细胞株 ，优化培养基组分

●清洗规范 ：

●避免强碱（ NaOH ）长时间接触（限 30 分钟内）

●清洗后立即中性保存，监测填料载量 /流速

●预处理 ：料液过滤/澄清减少色素负荷，延长填料寿命

四、总结

色素污染源于培养基、金属离子及蛋白相互作用，需根据色素性质（电荷、疏水性、分子 量）选择去除策略。

色素是一个非常复杂和难处理的问题，有时候无法靠单一的策略去除，需要查找原因，综合样品分析，过程优化，甚至填料筛选等，找到来源，然后设计系统的试验CIP方案，最终彻底解决这个问题。

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