评价多产品使用protein A填料纯化在单克隆抗体生产中应用可行性

评价多产品使用protein A填料纯化在单克隆抗体生产中应用可行性

原创：BVSbio

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研究速览

 1 介绍 

按照GMP的要求，层析填料在临床药物生产过程中大量的使用。但是一般都是用于单一的产品后即使没有达到填料寿命周期也会扔掉，因为担心从上一个项目潜在的蛋白残留转移下一个项目中。在本研究中，我们遵循目前商业化药物对填料寿命的研究方法，使用MabSelect PrismA™ 填料纯化不同产品的可行性。采用三种不同的单克隆抗体作为模型分子。通过色谱图谱、产率、除杂效果、压力和产品质量来评价层析柱的性能。蛋白质残留试验（protein carryover）研究旨在证明，不管填料在三个抗体捕获过程中接触次数和顺序，柱清洗程序都可以将蛋白质残留降低到安全水平。试验结果显示，经过多达90个循环（每个抗体30个循环），纯化过程中的蛋白残留对工艺性能的影响可以忽略不计。产品质量是一致的，即使有发现Protein A配体有脱离增多的趋势，但不影响研究的结论。虽然研究仅限于三种抗体，但填料再利用的概念已经显示可行的。

 

在生物制药行业中，柱层析由于易于放大，重复性好，已经是重组蛋白最常见和最有效的纯化技术之一，在临床药物生产中，一种填料通常是专门用于单一产品的。然而，层析填料，如protein A，其成本为每升数千美元，往往在柱寿命没有结束前就被丢弃，没有得到充分的利用。在药物临床研究阶段，基本3-20次就会被扔掉，即使填料寿命被验证可以使用100-200次。从一个产品转到下一个产品生产是一个非常耗时耗力的过程，包括缓冲液配置、人员、基础设施、文档等。层析柱需要拆卸，重装，验证等。考虑到质量和程序的控制，GMP厂房中的产品转移减少了整个厂房50%左右的生产能力。

多产品同用一种填料不是生物制药临床药物生产传统策略。但是，对于其可行性和安全性研究是一个非常有价值的研究。特别是目前全球原料短缺，比如COVID-19疫情，如果能够多个产品使用同一填料成为可能，将可以增加GMP厂房的生产能力和更快地生产出药物，对病人而言是非常有价值的。同时也可以减少浪费和生产用水，比如CIP，缓冲液制备，平衡，柱子的装填和拆卸。

 虽然不同产品之间利用同一填料是提高填料的利用率有效方法，但是从一个产品到另一个产品转移过程中，产品和杂质的残留是一个主要的问题。这个问题目前主要是由于有限的文献和数据，无法显示多产品使用同一填料对产品质量，安全性和生产过程的影响。

这里，我们选用了protein A填料和三个不同的lgG1单克隆抗体作为研究。三种抗体经过不同规模的protein A层析柱子层析纯化，而且采用随机分散上样的模式以排除上样顺序的影响。层析柱采用有效的NaOH清洗程序保证柱子清洗良好。最后，我们总结一个全面的一套风险评估策略，如果可以满足，就能够支持在临床GMP生产过程中重复利用填料。

 

2 材料与方法

2.1 化学试剂，单抗和Protein A

2.1.1 单抗

所有三种分子（A、B和C）都是IgG1型，在CHO细胞中产生2周，活细胞密度值高达3000万/ml。阿斯利康生产，pI值分别为8.1-8.9、8.9、9.0-9.3和8.5-9.1。

2.1.2 化学试剂

所有化学品均购自VWR（Radnor，美国）。所有缓冲液均使用与相应临床GMP生产过程中使用的原料等级相当的原料制备。

2.1.3 Protein A 填料

Resin： MabSelect PrismA resin， Cytiva Marlborough，MA,USA

Packed Column： 1.15 diameter Vantage column (Millipore, Burlington, USA) ，CV：18.7， Bed height：18cm

2.2 仪器

AKTA，Cytiva

2.3 分析

2.3.1 蛋白浓度： OD280nm

2.3.2 宿主蛋白HCP: ELISA

2.3.3 宿主DNA: qPCR

2.3.4 Carryover protein： FIPA (Flow injection protein assay)

2.3.5 聚合体： HPSEC,TSK3000 column

2.3.6 残留protein A：sandwich immunoassay

2.3.7 纯度：毛细管电泳

2.3.8 二甲基硅油（Simethicone):ICP-MS

2.3.9 普鲁酸（Pluronic acid）：ELSD

 

2.4 试验

Protein A亲和层析作为捕获步骤。发酵样品经过0.2um过滤，然后上样，载量70g/L。

平衡液：50mM Tris，pH7.4，洗脱前用高盐wash，然后再平衡。

洗脱：醋酸缓冲液，pH3.6，收样：0.5 OD-0.5OD

Strip：100mM 醋酸

Wash：WFI

消毒：0.1 N NaOH for 3CV.

流速：300cm/hr （上样和洗脱速度：150cm/hr）

保存：2%（v/v）苯甲醇，100 mM醋酸钠，pH 5.0

试验设计见图1：

2.4.1 Carryover 计算

3 结果与讨论

3.1 残留蛋白（Carryover protein）结果

残留蛋白低于仪器检测限（3ug/ml)。经过100 mM醋酸，低pH，然后在0.1 M氢氧化钠 高pH暴露高于8分钟，生物肽键将被水解，蛋白就会降解或变性失去生物活性。这步层析经过如此如此复杂的处理，这个结果是非常令人欣慰的。对于基于剂量的限制考虑，最低剂量的1/1000限度是残留蛋白的可接受范围。如果我们保守地估计最低剂量为1 mg，最大可接受的残留蛋白限制为0.1%或1000 ppm。表1 显示了所有样品不管层析顺序如何，蛋白残留值均符合要求（所有值均小于0.014%）。

3.2 工艺性能及产品质量结果

从Figure 2a-2f， 三个抗体经过90次层析，收率，纯度，HCP，DNA,聚合体和电荷异构分布等指标没有发现明显的变化趋势。从Figure 3显示，残留protein A经过90次循环后有增长趋势，特别是抗体C。由于抗体C是与A和B交叉上样的，从趋势而言，protein A残留是与样品相关的。除此之外，从Figure 2看，泄露的protein A并不影响层析收率。没有更多捕获产品数据。根据经验，在随后的纯化步骤如离子交换，HIC等可以把残留的protein A去除到药物物质限制水平之内。从整个工艺角度而言，后面的纯化步骤应该要明确残留protein A去除的载量和去除能力上限。另外，对于最后产品放行质量检测也是确保产品安全的一个策略选择。最后，在整个过程中对所有分子的普鲁酸和和二甲基硅油检测结果显示，所有检测值均低于质量限度（15μg/mL和1.32μg/mL），并且在90个循环中没有变化。

4 结论

本研究旨在提供一个多产品填料再利用的数据。数据表明，经过多达90个层析循环，三种单克隆抗体，每个抗体30个循环，多产品填料再利用是可行的。该研究特意挑选最昂贵的填料protein A（protein A填料的成本与其他传统填料相比成本至少高出50%）和最复杂的上样过程作为挑战性研究，体现其最高的经济效益。另外使用两种IgG1抗体，来源于商业生产规模（15,000升生产生物反应器），采用同样的层析方法，从捕获到精纯（数据未显示），进一步支持了该研究可行性评估。这些结果表明，在填料柱子装填合格下，即使使用不同的批次的填料，结果都是一致的。

蛋白质转移残留水平均低于0.014%。工艺性能和产品质量经过在90个循环使用后没有显示出任何有意义的趋势。唯一的例外是残留protein A配体，显示出有增加的趋势。综合药物物质和药品产品质量放行标准，产品安全使用数据，这种趋势结果并不会影响产品质量。

最后建议使用多产品重复使用填料的客户，需要收集相关的和可信的数据，运行风险评估表来显示该方法的适用性。所有的问题都是正面的，才能使得填料重复使用的成为可能。Table 2给出了一个例子，另外还需要考虑操作背景，分子形态，商业模式和法规指南等。也就是说，与监管机构的沟通有利于该策略的实施。随着临床试验的而全球化，这种沟通越来越重要。然而，在临床开发的初始阶段采用更区域性的市场是常见的情况，这是风险评估的建议标准之一，因此获取一两个监管当局同意是合理的。

源文献：

Nivetita Ravi,Javier Huerta ,Gisela Ferreira Evaluating multiproduct chromatography Protein A resin reuse for monoclonal antibodies in biopharmaceutical manufacturing. Biotechnol. Prog. 2023;39(3):e3333

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