吐温80（PS-80）降解途径及提高双抗制剂稳定性研究

吐温80（PS-80）降解途径及提高双抗制剂稳定性研究

作者 BVSbio

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   聚山梨酯80，又称吐温PS-80，是生物制剂常用的辅料和稳定剂。PS-80是两性非离子表面活性剂，添加到制剂中，可以防止蛋白储存过程变性，聚集或絮凝作用，从而增加制剂的稳定性。

   聚山梨酯80（PS80）是一种非离子表面活性剂，临界胶束浓度（CMC）为0.0017%（wt/v）。PS80头部有一个山梨聚糖基团，其中延伸出4条聚氧乙烯炔（POE）链。理论上，每个头部基团总共有20个POE单位，实际上，可能会有或多或少的数量。通常，POE单位的数量是一个高斯分布，就变成了非均匀混合物。在四条POE基团链中，有1到3个在其末端酯化为脂肪酸（FAs），这些脂肪酸也可以被乙醇终止。在PS80中发现的FAs有14到18个碳长，多达3个双键。最丰富的脂肪酸是油酸（58%，18碳，1个双键），其次是亚油酸（18%，18碳，2个双键）。单个梨聚糖基团上的FA数量从0到4不等。PS80也有0到2个异山梨酯头基团。也存在大量的POE-FAs未附着于头组。所有这些组分都产生了不同的非均匀混合物。

    由于其表面活性和小分子量，PS80与表面活性蛋白等单克隆抗体竞争界面表面积。通过阻止蛋白质表面吸附，聚山梨醇酯降低了高的局部界面蛋白浓度以及吸附介导的构象变化（adsorption-mediated conformational perturbation）。

   尽管PS-80可以阻止生物活性分子的降解，但是PS-80本身也容易被降解，主要通过酯水解和氧化被降解。研究发现，酯水解主要通过酸，碱或脂肪酶或酯酶。特别对于高浓度的抗体制剂，酶降解已经成为制剂不稳定的主要原因，这些酶主要来自于宿主蛋白（HCPs），即使是ng/ml水平，都可以使得PS-80降解。氧化作用降解PS-80主要来自于生产过程的过氧化物或金属残留在光作用下发生氧化。

PS-80 降解途径

   Nicholas等研究了聚山梨醇酯80（PS80）降解、酶解酯水解和氧化的2条主要途径。降解的聚山梨醇酯通过质谱进行定量分析，以确定单个成分的损失。接下来，利用朗缪尔槽吸附等温线来表征降解的聚山梨醇酯表面活性的变化。通过水解的PS80降解导致表面吸附速率较慢，而氧化的PS80的表面活性虽然增加，但是临界胶束浓度保持不变。通过利用对一种单克隆抗体的研究发现，水解聚山梨酯在震荡情况下颗粒的形成大量增加。氧化后的PS80对单克隆抗体的聚集仍具有保护作用。其的单体损失与包含PS80的配方和有酯酶水解PS80的配方中的单体损失相当。氧化后的PS80的单体损失与未降解的PS80相似。PS80水解产生游离脂肪酸，在机械搅拌过程中形成不溶性颗粒增加了抗体的聚集。

   对于抗体而言酶降解作用是可能是引起抗体聚合的主要原因。所以对于抗体纯化而言，去除引起PS-80降解的酶是非常重要。HCPs里包含了一些脂肪酶等引起PS-80降解的酶。

   Jessica等在研究双抗纯化过程中，也发现和研究了HCPs对PS-80降解从而造成双抗制剂稳定性的问题。通过采用陶瓷羟基磷灰石（CHT）纯化双抗（图1），找到目的蛋白（表1），经过小试和中试优化（表2），经过LC/MS对HCPs进行了组分的分析（表3），尽管HCPs已经降低到很低的水平，仍然引起PS-80降解，从而造成双抗的制剂的不稳定。该研究通过CHT层析纯化双抗，不但有效的去除产品相关的杂质，对于过程中的杂质也很好的去除，通过对HCPs的组分研究，可以很好的的去除HCPs中的脂肪酶，有效的减少了对PS-80的降解（图2），提高了双抗的稳定性。

        图 1 CHT纯化双抗层析图谱

 

 表1 CHT阶段洗脱样品分析

 

表2 小试和中试层析结果总结 

表3 HCPs经过LC/MS组分分析

 

图2 双抗制剂中PS-80分析

参考文献

1.Martos A, Koch W, Jiskoot W, et al. Trends on analytical characterization of polysorbates and their degradation products in biopharmaceutical formulations. J Pharm Sci. 2017;106:1722-1735.

2.Nicholas R. Larson , Yangjie Wei , Indira Prajapati et al.Comparison of Polysorbate 80 Hydrolysis and Oxidation on the Aggregation of a Monoclonal Antibody.Journal of Pharmaceutical Sciences 109 (2020) 633-639

3.Jessica A. Waller1, Ji Zheng1, *, Rachel Dyer et al.Ceramic hydroxyapatite chromatography plays a critical role in bispecifific antibody purifification process for impurity removal.Antibody Therapeutics, 2023, Vol. 6, No. 1 30–37

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